GLP-1(povezava:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) je polipeptidni hormon, sestavljen iz 30 aminokislin. S poglobljenimi raziskavami GLP-1 je bilo razvitih vedno več sintetičnih metod. Ta članek bo sistematično predstavil trenutno znane metode sinteze GLP-1.
1. metoda, sinteza v trdni fazi:
Sinteza v trdni fazi je široko uporabljena metoda za sintezo peptidov in proteinov, pogosto pa se uporablja tudi za sintezo GLP-1. Pri sintezi v trdni fazi se jedrna struktura oblikuje s povezavo prve aminokisline s smolo. Nato se v zaporedju doda naslednja aminokislina in kemično reagira z ustreznim kondenzacijskim sredstvom. Končno lahko ciljni produkt dobimo s cepitvijo polipeptida iz smole.
Pomen trdnofazne sinteze je v tem, da omogoča avtomatizacijo in obsežno proizvodnjo peptidne sinteze. Trenutne glavne metode sinteze v trdni fazi vključujejo Fmoc in Boc. Med njimi metoda Fmoc uporablja zaščitno skupino N-Fmoc za zaščito peptida, medtem ko metoda Boc uporablja tert-butiloksikarbonil za zaščito karboksilne skupine.
Druga metoda, sinteza tekoče faze:
Sinteza v tekoči fazi je tradicionalna metoda sinteze peptidov, pri kateri se reaktanti postavijo v tekočo fazo za reakcijo. Prednost tekočefazne sinteze je, da so reakcijski pogoji blagi in primerni za modifikacijo občutljivih kemičnih struktur. Vendar pa je zaradi preveč reaktantov postopek čiščenja razmeroma okoren. Kemijske reakcije v sintezi tekoče faze vključujejo:
1. Reakcija kondenzacije:
Kondenzacijska reakcija je ena najbolj osnovnih reakcij v sintezi peptidov, kar pomeni, da je karboksilna skupina, ki jo sprožijo kondenzacijska sredstva, kot sta DCC in HOBt, povezana z amino skupino aminokisline prek reakcije aciliranja. Reakcijski pogoji so blagi in izkoristek je visok.
2. Reakcije izločanja:
Reakcija izločanja je redukcija metionina v ditiol z NaBH4 in drugimi redukcijskimi sredstvi, zaradi česar je neaktiven. Reakcijo je treba izvesti v bazičnih pogojih.
3. Odstranitev zaščitnih skupin:
Zaradi različnih funkcij aminokislin v peptidni verigi bodo za zaščito uporabljene različne zaščitne skupine. Po končani sintezi je treba zaščitno skupino odstraniti. Pri metodi Fmoc se piperidin običajno uporablja za odstranitev Fmoc; medtem ko se pri metodi Boc za odstranitev Boc uporablja TFA.
Tretja metoda, kemična sinteza:
GLP-1 je polipeptidni hormon s pomembnimi biološkimi aktivnostmi. Njegovo sintezo lahko izvedemo z različnimi metodami, med katerimi je kemična sinteza ena najpogosteje uporabljenih metod. Prednost kemijske sinteze je, da lahko proizvede zelo čiste ciljne produkte, ki so primerni za velikoserijsko proizvodnjo. Metoda kemične sinteze in podrobni koraki GLP-1 bodo predstavljeni spodaj.
1. Sintetična pot in izbira zaščitne skupine:
Molekula GLP-1 je sestavljena iz 36 aminokislin, vključno z 21 aminokislinami tipa L in 15 aminokislinami tipa D. Pred izvedbo sinteze je treba izbrati primerno sintezno pot in izbrati ustrezno zaščitno skupino glede na sintetične pogoje. Fmoc trdnofazna sinteza se običajno uporablja za avtomatizirano obsežno sintezo. Ta metoda uporablja N-9-fluoroimido karboksilno zaščito (N-Fmoc) kot zaščitno skupino in mora izbrati tudi ustrezno sekundarno zaščitno skupino (kot je tert-butil ali metil), da zagotovi zaščito določenih mest. Vsakič, ko se doda nova aminokislina, je treba najprej odstraniti zaščitno skupino Fmoc, nato pa dodati zaščiteno spojno snov naslednje aminokisline.
2. Sinteza osrednjega aminokislinskega zaporedja:
Osrednje zaporedje GLP-1 je sestavljeno iz 21 aminokislin, vključno s ključnim zaporedjem serina in štirimi dipeptidnimi zaporedji prolil-glutaminske kisline. Pri sintezi v trdni fazi lahko sintezo jedrnega zaporedja razdelimo na naslednje korake:
2.1. Dodajte karbamat ocetne kisline (Fmoc-NH-CH2CO2Et) in 2-Cl-Trt-Cl sintetični smoli v trdni fazi in izvedite kondenzacijsko reakcijo s spojilnim sredstvom DIC/NMM.
2.2. Odstranite zaščitno skupino Fmoc z deprotekcijo reakcije skupine.
2.3. Dodajte naslednjo aminokislino, ponovite korak 1 in korak 2 zaporedoma, dokler ni sintetizirano jedrno zaporedje.
2.4. Tvorba pentapeptidnih struktur na smoli v trdni fazi. Dodajte acetalizacijski reagent smoli v trdni fazi, reagirajte s sredstvom za prepoznavanje N-terminala (kot je HBTU), dodajte zaščitno skupino stranske verige serina kot pomožno redukcijsko sredstvo in nato odstranite zaščitno skupino Fmoc.
2.5. Pod katalizo Bacillus subtilis transferaze (ProTide) je struktura pentapeptida podvržena reakciji izmenjave s prekurzorjem serin jodoacetata.
3. Sinteza preostalega aminokislinskega zaporedja:
Po končani sintezi jedrnega zaporedja je treba nadaljevati z dodajanjem preostalih aminokislin, vključno z aminokislinami tipa L in D. Dodajanje teh aminokislin se mora začeti pri jedrnem zaporedju, dodati naslednjo aminokislino v zaporedju in uporabiti ustrezno kondenzacijsko sredstvo za izvajanje kemičnih reakcij, dokler ni sintetizirana celotna polipeptidna molekula GLP-1. Med tem postopkom je treba izbrati tudi ustrezno zaščitno skupino, kot je potrebno, in izvesti korake reakcije, odstranitve zaščitne skupine in dodajanja aminokisline v zaporedju.
4. Zdravljenje z natrijevim hidroksidom:
Ko so bile dodane vse aminokisline, se na smoli v trdni fazi oblikuje nepopolno sintetizirana peptidna veriga, ki jo je treba obdelati, da se tvori popolnoma oblikovana peptidna molekula. Najprej je treba neformirani peptid hidrolizirati z natrijevim hidroksidom, tako da se C-terminalna karboksilna skupina, prvotno vezana na smolo, loči od smole, zaščitna skupina pa se loči v vodi. Po reakciji hidrolize dobimo ciljni produkt.
5. Padavine in pranje:
Po obdelavi hidrolizirano raztopino obdelamo s kislino, da oborimo ciljni produkt. Nato smo pelet resuspendirali v vodi, čemur je sledilo intenzivno pranje za odstranitev nečistoč.
6. Čiščenje:
Zadnji korak je čiščenje želenega produkta, običajno s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti. Med tem postopkom je mogoče določiti čistost produkta z zaznavanjem vrha raztopine v masnem spektru. Skratka, kemična sinteza GLP-1 zahteva več krogov zapletenih reakcij in strogih postopkov čiščenja, da končno dobimo aktivni ciljni produkt.
Četrta metoda, biosinteza:
GLP-1 je pomemben polipeptidni hormon z različnimi fiziološkimi učinki, vključno s spodbujanjem izločanja inzulina, zaviranjem apetita, zmanjšanjem telesne teže in vzdrževanjem občutljivosti za inzulin itd. Biosintezo GLP-1 večinoma sintetizirajo celice L v trebušni slinavki, hitrost njegove sinteze pa uravnavamo s hrano. Podrobni koraki so predstavljeni na naslednji način:
1. Pripravljalna dela pred sintezo:
Pred biosintezo GLP-1 je treba opraviti nekaj pripravljalnega dela, vključno z določitvijo vrste uporabljene celice, nastavitvijo pogojev kulture in izbiro ustreznega katalitskega encima. Celice L so glavni vir sinteze GLP-1, ker vsebujejo prekurzorja dveh hormonov, GIP (glukagonu podoben peptid 1) in GLP-1. L celice lahko izoliramo iz črevesnega epitelija zajcev ali miši. Pred biosintezo je treba celice vzgojiti v zadostnem številu, zagotoviti je treba dovolj hranil in primerne pogoje za kulturo. Poleg tega je treba izbrati ustrezen katalitični encim za spodbujanje reakcije.
2. Sinteza in predelava prekurzorjev:
Biosinteza GLP-1 poteka predvsem v celicah L, njegov predhodnik pa je sestavljen iz dveh hormonov, GIP in GLP-1. Po vstopu v endokrine celice GIP in GLP-1 predelata proteolitični encimi in cepita na posamezne peptide. V ta proces je vključena vrsta encimov in kofaktorjev, vključno s prekurzorsko polipeptidno acidazo (PC2), izomerazo in poznimi adhezijskimi faktorji.
3. Medsebojna pretvorba med polipeptidnimi segmenti:
Po obdelavi se peptida GIP in GLP-1 rekombinirata v polipeptid GLP-1. Ta proces zahteva uporabo glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1) kot matrice, na katero se združijo drugi posamezni peptidi, da tvorijo nove sestavljene polipeptide. Ta proces zahteva tudi nekatere specifične encime in dejavnike, vključno s prohormonsko konvertazo 1/3 (PC1/3) in karboksipeptidazo E (CPE).
4. Izločanje GLP-1:
Ko se GLP-1 sintetizira in predela, se shrani v citoplazmi in notranjih mehurčkih endokrinih celic. Ko jih spodbudi prehrana, endokrine celice sproščajo GLP-1 in vstopijo v krvni obtok skozi mikrožile. Ta proces je reguliran in nadzorovan prek vrste poti prenosa signala, vključno s cAMP-Ca2 plusin tako naprej.
Skratka, biosinteza GLP-1 vključuje skupno delovanje več povezav in dejavnikov. Kombinacija biosinteze in kemične sinteze lahko zagotovi boljšo osnovo in podporo za raziskave in proizvodnjo GLP-1.
Peta metoda, encimska sinteza:
Encimska sinteza je sinteza peptidnih verig s katalizo bioloških encimov. V primerjavi s tradicionalnimi metodami sinteze v tekoči fazi lahko encimsko sintezo izvedemo pri sobni temperaturi in lahko izberemo široko paleto surovin. Za kataliziranje sinteze se običajno uporabljajo encimi, kot so theta-liquid sinthase, AEP, ACE itd.
Skratka, zgoraj omenjene metode so izvedljive metode za sintezo GLP-1. Različne metode so primerne za različne eksperimentalne pogoje in okolja farmacevtske proizvodnje.