L-tioglutaminska kislinaje spojina naravnega proizvoda, ki se pretvori iz glukozinolatu podobnih prekurzorjev v zelenjavi grannymonda, kot so ohrovt, zelena gorčica in brokoli. Ima različne učinke na zdravje in se pogosto uporablja za preprečevanje kroničnih bolezni, kot so rak, bolezni srca in ožilja ter sladkorna bolezen. Veliko ga najdemo v rastlinah iz družine križnic, kot so ohrovt, cvetača in zelje. Ima številne farmakološke aktivnosti, kot so protirakavo, protivnetno, antioksidativno, nevroprotektivno itd. Zato je sintetična metoda L-tioglutaminske kisline pritegnila veliko pozornosti.
Trenutno lahko metode za sintezo L-tioglutaminske kisline razdelimo v dve kategoriji: biološko fermentacijo in kemično sintezo. Ti dve metodi sta podrobno opisani spodaj.
Metoda biološke fermentacije L-sulforafana:
Metoda biološke fermentacije je metoda sintetiziranja spojin z mikroorganizmi. S presejanjem bakterijskih sevov in optimizacijo pogojev kulture lahko mikroorganizmi med postopkom fermentacije proizvajajo L-tioglutaminsko kislino. Zdaj je bilo ugotovljeno, da lahko številni sevi sintetizirajo L-tioglutaminsko kislino, kot so Escherichia coli, Streptococcus thermophilus in tako naprej. Med njimi je najpogostejša metoda za sintezo L-tioglutaminske kisline s sevi, ki jih predstavlja Escherichia coli. Posebni koraki so naslednji:
1. Izolirajte seve, ki proizvajajo L-tioglutamat, kot je Escherichia coli, iz zemlje ali rastlinskega tkiva;
2. Za gojenje bakterije Escherichia coli izberite primeren medij in pogoje gojenja, kot so temperatura, vrednost pH, čas gojenja itd.;
3. Poberite fermentacijsko brozgo bakterije Escherichia coli, izvedite določeno obdelavo in čiščenje ter pridobite L-tioglutaminsko kislino.
Metoda kemične sinteze L-sulforafana:
Metoda kemijske sinteze je uporaba metode kemijske molekularne reakcije za sintezo L-tioglutaminske kisline po različnih sintetičnih poteh. Trenutno so metode kemične sinteze v glavnem razdeljene na štiri vrste: metoda holinske soli, metoda sulfuril klorida, metoda karbonilne redukcije in metoda agaroznega sulfata.
1. Metoda holinske soli:
Ta metoda je ena izmed pogosto uporabljenih sintetičnih metod. Nadaljujte kot sledi:
① Najprej L-metionin in holin reagirata v kislih pogojih, da nastane redek dušikov nadomestek L-tioglutaminske kisline.
② Segrevanje in hidroliziranje dušikovih nadomestkov v L-tioglutaminsko kislino v alkalnih pogojih.
Prednost te metode je, da je reakcija preprosta in jo je enostavno obvladati, vendar je izkoristek nizek.
2. Metoda s sulfonilkloridom:
Ta metoda uporablja elektrofilno substitucijsko reakcijo za sintezo L-tioglutaminske kisline. Nadaljujte kot sledi:
① Reakcija L-metionina in sulfonilklorida v alkalnih pogojih, da dobimo sulfinat L-tioglutaminske kisline.
② Sulfinat hidroliziramo v alkalnih pogojih, da nastane L-tioglutaminska kislina.
Prednost te metode je, da je reakcijo enostavno nadzorovati in je izkoristek visok, vendar je treba uporabiti strupen sulfonilklorid.
3. Metoda redukcije karbonila:
Metoda je uporaba redukcijske reakcije za sintezo L-tioglutaminske kisline. Nadaljujte kot sledi:
①L-metionin reagira z acetoniminom, da hkrati tvorita piridin pirimidin-2-en-4-on in pirimidin pirimidin-2-en-4-on-5-sulfat
②Pirimidin pirimidin-2-en-4-on-5-sulfat se reducira, da se pridobi L-tioglutaminska kislina.
4. Metoda z agaroznim sulfatom: Ta metoda je reakcija L-metionina in agaroznega sulfata v kislih pogojih, da nastane L-tioglutaminska kislina. Zaradi dobre katalitične aktivnosti sulfata se učinkovitost in selektivnost reakcije izboljšata. Višja, a bolj okorna za upravljanje.
V znanstvenih raziskavah je odkrivanje L-sulforafana zelo pomembno. Med njimi je metoda agaroznega sulfata ena izmed klasičnih detekcijskih metod. Metoda z agaroznim sulfatom in njeni koraki bodo podrobno opisani spodaj.
Eksperimentalni princip
Metoda z agaroznim sulfatom temelji na tvorbi rumenega kompleksa L-tiogalaktopikrina in barijevega sulfata, soli, ki nastane v kislih pogojih, z uporabo agaroze kot ogrodja za ločevanje L- Metoda sulforafana. Metoda temelji na dejstvu, da v kislih pogojih rumeni kompleks, ki nastane z reakcijo barijevega sulfata in L-sulforafana, ni zlahka topen v vodi in se obori v agarozi, tako da se loči in zazna L-sulforafan.
Eksperimentalni koraki:
1. korak: Pripravite suspenzijo agarozno-barijevega sulfata
Stehtajte ustrezno količino agaroze in barijevega sulfata, po mešanju dodajte določeno količino destilirane vode in temeljito premešajte, segrevajte, dokler se ne raztopita ali enakomerno premešata, filtrirajte suspenzijo s filtrom z velikostjo por 0,22 um in nato vreti 3 do 5 minut. Ko se suspenzija ohladi pod 50 stopinj, vendar se še vedno ne strdi, raztopino vlijemo v petrijevko in jo postavimo na sobno temperaturo, dokler se ne strdi.
2. korak: Priprava in obdelava vzorca:
Stehtajte vzorec ali standard, ki ga želite testirati, dodajte dovolj {{0}}.01 M raztopine natrijevega pirofosfata, da se raztopi, dodajte ustrezno količino kloroforma za ekstrakcijo, centrifugirajte 10-15 minut , odstranimo tekočino zgornje plasti, odparimo kloroform, da zberemo ostanek, dodamo 2 mL vode in 2 mL koncentrirane klorovodikove kisline, ponovno ekstrahiramo s kloroformom, centrifugiramo in vzamemo zgornjo plast. Vzamemo 24 mL zgornje tekočine, dodamo 0,2 mL 2-odstotne raztopine bakrovega nitrata in 0,4 mL 5-odstotne raztopine svinčevega nitrata, enkrat ekstrahiramo s kloroformom, centrifugiramo in vzamemo zgornjo tekočino, ki jo lahko uporabimo kot poskusni vzorec za testiranje.
3. korak: poskus ponovne analize:
Vzorce smo dodali suspenziji agaroza-barijevega sulfata in segrevali v vodni kopeli, da se strdijo pri 80 stopinjah 2 uri. Ko se vzorec strdi, se suspenzija agarozno-barijevega sulfata ohladi na sobno temperaturo in kompleks agarozno-barijevega sulfata in vzorca raztopi v pufrskih pogojih citronske kisline in amonijeve soli. Nazadnje zaporedno sperite z vodo in vizualno preglejte barvo kompleksa v agarozni krogli.
4. korak: Analiza rezultatov:
Izmerite absorbanco filtrata po ponovni analizi, da sestavite standardno krivuljo in tako dobite vsebnost L-sulforafana.
Metoda z agaroznim sulfatom je klasična metoda za ločevanje in odkrivanje L-sulforafana. Z nizom korakov je mogoče ločiti L-sulforafan in zaznati njegovo vsebnost. Metoda ima prednosti preprostosti, visoke občutljivosti in natančnih rezultatov ter se običajno uporablja pri odkrivanju L-sulforafana v hrani, kozmetiki in farmacevtskih izdelkih.
Povzetek: Z razvojem znanosti in tehnologije se metoda sinteze L-tioglutaminske kisline nenehno optimizira in izboljšuje. Hkrati imata metoda biološke fermentacije in metoda kemične sinteze tudi svoje prednosti in slabosti, katero metodo uporabiti pa je odvisno od dejanskega stanja.