Streptavidin Sigma CAS 9013-20-1

1. Spoznajte streptavidin
Streptavidin (SA), izločeni protein, pridobljen iz Streptomyces avidinii, ima molekulsko maso približno 65-66 kDa in izoelektrično točko okoli 6,0. Je tetramerni protein, sestavljen iz štirih homolognih podenot, od katerih ima vsaka neodvisno vezavno mesto za biotin – kar pomeni, da se lahko ena molekula streptavidina hkrati veže na štiri molekule biotina. Konstanta disociacije (Kd) med obema je tako nizka kot približno 10 ⁻¹5 M, kar je ena najmočnejših znanih nekovalentnih bioloških interakcij in jo je mogoče obravnavati kot najbolj natančen "mehanizem molekularnega zaklepanja" v naravi.

V primerjavi z avidinom, pridobljenim iz jajčnega beljaka, ima neprimerljive prednosti:

Ne vsebuje modifikacij glikozilacije, je na splošno električno nevtralen, zato ima izredno nizko ne-specifično vezavo v fizioloških pogojih, čisto eksperimentalno ozadje in odlično razmerje-in-šumom. Poleg tega je njegova odlična odpornost na denaturacijo in proteazno razgradnjo ter njegova sposobnost, da vzdrži ekstremen pH, visoke temperature (70-80 stopinj C), organska topila in običajna sredstva za denaturacijo (kot sta SDS in sečnina), so nadomestili avidin in postali nesporen "zlati standard" v sistemih za vezavo biotina.

Ravno s temi izjemnimi lastnostmi blesti na področjih, kot so znanosti o življenju, in vitro diagnostika, presejanje zdravil in biosenzor.

2. Imunsko testiranje
Aplikacija na področju imunske detekcije je njegova najbolj klasična in razširjena aplikacija. Od svojega razvoja v poznih sedemdesetih letih prejšnjega stoletja je biotin streptavidin sistem (BAS) zaradi svoje ultra-visoke afinitete in učinka kaskadnega ojačanja postal temelj imunskega označevanja in analize sledenja. Po statističnih podatkih približno 85 % običajnih kemiluminiscenčnih analizatorjev uporablja metode odkrivanja, ki temeljijo na BAS, kar kaže na njihov prevladujoč položaj.

2.1 Encimski imunski test (ELISA)

Pri testu ELISA je mogoče spojiti hrenovo peroksidazo (HRP) ali alkalno fosfatazo (AP) in encim je mogoče natančno voditi do tarče prek biotiniliranih protiteles. HRP katalizira luminiscenčne substrate TMB, DAB ali ECL za ustvarjanje močnih kemičnih ali optičnih signalov, medtem ko AP katalizira BCIP/NBT, PNPP in druge substrate za ustvarjanje stabilnih barvnih ali kemiluminiscenčnih signalov. Biotinilirana tarčna molekula se lahko veže na večkrat označen streptavidin, s čimer doseže več{2}}ojačitev signala in omogoči zaznavanje tarč z nizko abundanco. Ta tehnologija se pogosto uporablja v sendviču in konkurenčnem testu ELISA, ki zajema scenarije, kot so kvantifikacija beljakovin, odkrivanje protiteles, presejanje patogenov itd.

2.2 Proteinsko imunoblotiranje (Western Blot)
Pri Western Blotu lahko vezava z biotiniliranimi sekundarnimi protitelesi znatno poveča intenzivnost signala ciljnih proteinov na filmih za prenos. V primerjavi s tradicionalnimi sistemi sekundarnih protiteles lahko sistemi BAS dosežejo močnejše ojačanje signala zaradi svojih štirivalentnih vezavnih lastnosti. Poleg tega je zaradi nizke ne-specifične vezave streptavidina motnja ozadja znatno zmanjšana, zaradi česar so posebej primerni za kvantitativno analizo beljakovin z nizko vsebnostjo.

2.3 Imunohistokemija (IHC) in imunocitokemija (ICC)
Streptavidin, označen s HRP ali AP, je prednostno orodje za ojačanje signala za IHC in ICC. Sistem HRP je primeren za poskuse, ki zahtevajo izjemno visoko občutljivost zaznavanja, medtem ko je sistem AP še posebej primeren za sisteme, ki vsebujejo zaviralce HRP (kot je natrijev azid), ali eksperimentalne scenarije, ki zahtevajo dolgoročen-razvoj barve in stabilnost signala. Z vezavo biotiniliranih sond ali protiteles na konjugate streptavidina lahko ciljne molekule natančno lociramo v odsekih tkiva ali vzorcih celic.

2.4 Imunofluorescenca (IF) in in situ hibridizacija (ISH)

Streptavidin, označen s fluoresceinom (kot je FITC Streptavidin, PE Streptavidin, APC Streptavidin), je univerzalno vizualizacijsko orodje za imunofluorescenčno barvanje in in situ hibridizacijo. Marker FITC ima valovno dolžino vzbujanja/emisije približno 494/519 nm in kaže svetlo zeleno fluorescenco; Valovna dolžina vzbujanja/emisije markerja PE je približno 565/578 nm, kar je "zlati standard" za analizo več-barvne pretočne citometrije; Označevalnik APC pokriva daleč rdeči spekter, kar omogoča več-barvno slikanje. Ti fluorescentni markerji se lahko natančno vežejo na biotinilirana protitelesa ali sonde nukleinske kisline, da dosežejo analizo lokalizacije in kvantitativno detekcijo ciljnih molekul.

2.5 Pretočna citometrija (FACS)

Pri pretočni citometriji se fluorescentno označeni streptavidin (zlasti označen s PE) uporablja za odkrivanje antigenov celične površine, označenih z biotiniliranimi protitelesi. Njegova odlična svetlost zagotavlja izjemno visoko razmerje-in-šumom, ki lahko učinkovito zazna celične populacije z nizko izraženostjo površinskega antigena ali šibkimi signali. Je nepogrešljiv reagent pri analizi več-barvne pretočne citometrije.

2.6 Encimsko vezan imunski test (ELISPOT)
Streptavidin, označen z AP, kaže odlično učinkovitost v ELISPOT in je primeren za analizo trdne -faze in sisteme za barvanje tkiv/celic. Stabilno lahko katalizira proizvodnjo substrata signalov s štetjem točk za zaznavanje izločanja citokinov na ravni ene -celice.

3. Čiščenje beljakovin in nukleinskih kislin
3.1 Afinitetna kromatografija in čiščenje proteinov
Streptomicin je osrednja komponenta pakiranja afinitetne kromatografije. Po označevanju z biotinom beljakovine, ki jih je treba očistiti, se le-ta zmeša s streptavidinskim agaroznim gelom (kot je Streptavidin Agaroza/Sefaroza) in označena beljakovina se tesno veže na streptavidin na polnilu. Z izpiranjem, da se odstranijo nečistoče, in nato izpiranjem ciljnega proteina pod ustreznimi pogoji (kot je vreli pufer SDS-PAGE, obdelava z 0,1 % SDS ali obdelava s 95 % formamidom+10 mM EDTA pri pH 8,2), je mogoče dobiti produkte visoke-čistosti.

Če za primer vzamemo industrijsko proizvodnjo rekombinantnega humanega insulina, lahko visoko{0}}kakovostne magnetne kroglice streptavidina vežejo več kot 1200 pmol prostega biotina na miligram, čistost prečiščenih beljakovin pa lahko doseže več kot 95 %.

3.2 Imunoprecipitacija (IP) in kromatinska imunoprecipitacija (ChIP)
Uporaba magnetnih kroglic streptavidina pri imunoprecipitaciji močno izboljša eksperimentalno učinkovitost. Raziskovalci lahko fiksirajo biotinilirana protitelesa na magnetne kroglice streptavidina in jih soinkubirajo s celičnim lizatom.

Protitelesa specifično zajamejo ciljni protein in njegove medsebojno delujoče proteine, pri čemer tvorijo kompleks "tarčnega proteina protitelesa magnetnih kroglic". Lahko se hitro loči pod delovanjem zunanjega magnetnega polja, z enostavnim upravljanjem in visoko občutljivostjo. V poskusih ChIP so bile uporabljene tudi magnetne kroglice streptavidina za zajemanje proteinskih kompleksov biotinilirane DNK in preučevanje interakcije med beljakovinami in DNK.

3.3 Povlečni poskus
Pri preučevanju interakcij beljakovin-beljakovin lahko magnetne kroglice zajamejo biotinilirane beljakovine vab in nato "lovijo ribe" za predproteine, ki z njimi sodelujejo. Na primer, ko preučujemo ključne signalne poti v tumorskih celicah, so specifična protitelesa, ki prepoznajo protein P53, imobilizirana na magnetnih kroglicah streptavidina in soinkubirana z lizatom tumorskih celic, da učinkovito obogatijo P53 in z njim povezane proteine. V primerjavi s tradicionalnimi metodami imunoprecipitacije ima IP z magnetnimi kroglicami večjo občutljivost in specifičnost ter lahko učinkoviteje obogati ciljne beljakovine z nizko abundanco.

3.4 RNK Pull-dol
Magnetne kroglice so primerne tudi za eksperimente z vlečenjem{0}}RNK. Po vezavi z magnetnimi kroglicami streptavidina lahko biotinilirane RNA sonde zajamejo proteine, ki interagirajo z RNA iz celičnih lizatov, za preučevanje mrež interakcij proteinov RNA.
3.5 Priprava enoverižne DNA in ekstrakcija nukleinske kisline
Lahko se veže z biotiniliranimi oligonukleotidi za pripravo enoverižne DNK in učinkovito ekstrakcijo nukleinskih kislin, igra pomembno vlogo pri molekularnem kloniranju in genskem inženiringu.

4. Visoko zmogljivo odkrivanje in pregledovanje zdravil
4.1. TR-platforma za testiranje FRET
Lahko se poveže z luminiscenčnimi kelati, kot so europijevi kelati, za izvedbo povezovanja signala in zajem molekul v sistemu za zaznavanje TR-FRET (časovno-ločljivi fluorescenčni resonančni prenos energije). Na primer, THUNDER ™ Streptavidin, označen z evropijem, posebej zasnovan za eksperimentalno platformo TR-FRET, se lahko stabilno veže na različne biotinilirane modificirane molekule in se pogosto uporablja v analizi interakcij beljakovin in predhodnem pregledu tarčnih zdravil.

Ta sistem je homogen in visoko{0}}zmogljiv, zaradi česar je močno orodje za razvoj sodobnih zdravil.

4.2 Ciljno dajanje zdravil
Zaradi njegovih lastnosti vezave biotina je idealen nosilec za ciljno usmerjene sisteme za dostavo zdravil. S povezovanjem molekul zdravila z biotinom in uporabo ciljne vezavne sposobnosti streptavidina je mogoče doseči natančno dostavo zdravila, izboljšati učinkovitost zdravljenja in zmanjšati stranske učinke.

4.3 Biosenzorji in biočipi

Je osnovni material za proizvodnjo biosenzorjev in biočipov. Z imobilizacijo streptavidina na površini čipa kot elementa za zajemanje je mogoče nanj imobilizirati beljakovinske sonde ali protitelesa, označene z biotinom, s čimer dosežemo visoko-prepustnost in visoko-občutljivost zaznavanja. Na primer, pri zgodnjem presejanju beljakovinskih čipov za srčno-žilne bolezni so magnetne kroglice streptavidina pritrjene na substrat čipa in uporabljene za vezavo biotiniliranih proteinskih sond. To lahko natančno odkrije nenormalnosti pri bolnikih v zgodnjih fazah bolezni in ko so koncentracije krvnih markerjev tako nizke kot cTnI 0,01 ng/mL, kar diagnostično okno pomakne za 2-3 ure v primerjavi s tradicionalnimi diagnostičnimi metodami.

5. Celična biologija in slikanje
5.1 Označevanje celične površine in fluorescentno razvrščanje celic
Fluorescentno označeni streptavidin (kot je Vari Fluor 488 Streptavidin) se pogosto uporablja za označevanje celične površine in fluorescenčno razvrščanje celic. Njegov emisijski spekter pokriva celoten spekter vidne in bližnje-infrardeče svetlobe, pri poskusih več-barvnega označevanja pa lahko zlahka vstopi v jedro in citoplazmatsko strukturo ter označi ciljne beljakovine za slikanje in analizo.

5.2 Nanotehnologija in samosestavljanje materialov
Zaradi njegovih štirivalentnih veznih lastnosti je idealen »most« za samo{0}}sestavljanje nanomaterialov. S ciljno vezavo biotina streptavidina je mogoče konstruirati različne nanostrukture za interdisciplinarne raziskave, kot sta biološko slikanje in spremljanje okolja.

6. Protitelesa proti streptavidinu
S široko uporabo streptavidinskega biotinskega sistema se je pojavila pogosto spregledana težava - endogena protitelesa proti streptavidinu (ASA) v vzorcu lahko motijo ​​sistem zaznavanja. Raziskave so pokazale, da lahko vezava ASA na SA v reakcijskem sistemu vpliva na pravilno konstrukcijo specifičnih antigenskih sistemov protiteles, kar ima za posledico ogroženo natančnost spajanja, odkrivanja ali diagnostičnih rezultatov.

Za reševanje tega izziva so se pojavili kompleti za odkrivanje protiteles proti streptavidinu, ki jih je mogoče uporabiti za odkrivanje endogene ASA v vzorcih bolnikov in preprečiti njeno motenje v sistemu BAS. Roche Custom Biotech je razvil neaktivni mutant streptavidina (Streptavidin rec. inactive, poly), ki ga je mogoče dodati trenutnemu sistemu brez dodatnih korakov za specifično blokiranje in odpravo motenj ASA, s čimer se izboljša natančnost in specifičnost sistema zaznavanja.

7. Interferenca biotina
Čeprav je biotinski sistem streptavidina močan, se sooča z vedno hujšim izzivom - interferenca biotina.

Ko je v testnem vzorcu visoka koncentracija prostega biotina, ta tekmuje z biotiniliranimi protitelesi za vezavno mesto streptavidina, kar povzroči popačene rezultate detekcije.

Peroralno dajanje 100 mg biotina lahko povzroči najvišjo koncentracijo v plazmi 375-450 ng/mL; Bolniki z multiplo sklerozo lahko jemljejo 300 mg/dan peroralno, njihova koncentracija biotina v plazmi pa lahko preseže 1000 ng/mL; Dnevni vnos 500 mg biotina lahko povzroči izjemno visoke koncentracije biotina v krvi. Pri sendvič imunskih testih lahko prekomerni biotin povzroči napačno nizke rezultate; Pri konkurenčnih imunskih testih lahko povzroči napačno visoke rezultate.

Številne študije so pokazale, da interferenca biotina v različni meri vpliva na TSH, tiroksin PTH, endokrine teste, kot so adrenokortikotropni hormon, prolaktin, testosteron, kortizol, pa tudi tumorske markerje in srčne funkcionalne markerje. FDA je zapored izdala opozorila in ustrezne smernice. Strategije obvladovanja vključujejo: serijsko redčenje vzorcev, prehod na metode brez BAS, kot je tekočinska kromatografija-masna spektrometrija, ponovno testiranje po očistku biotina (najkrajše kot 2 uri, vse do 15 dni ali celo mesecev) ali uporaba prostih čistilcev biotina.